安 娜 1 , 马晨曦 2

（1. 沈阳市环境技术评估中心，辽宁 沈阳 110011； 2. 沈阳建筑大学市政与环境工程学院，辽宁 沈阳 110168）

摘 要：厌氧氨氧化是一种以厌氧氨氧化菌的生化作用为核心的新型生物脱氮技术，具有良好的开发前景。然而由于厌氧氨氧化菌细胞产率极低，生长非常缓慢，且对环境条件较为敏感，使其不能很快地实现大规模的推广应用。根据厌氧氨氧化菌的生理生态学特性，从反应器和接种污泥两个方面综述了近年来国内外富集培养厌氧氨氧化菌的方法，并指出了今后研究的主要方向。

关 键 词：厌氧氨氧化菌； 富集培养； 反应器； 接种污泥

中图分类号：X 703 文献标识码：A 文章编号：1004-0935（2014）06-0727-05

厌氧氨氧化（ANAMMOX-anaerobic ammonia oxidation）是一种目前在废水生物脱氮领域内备受关注的新技术，为氮素的转化提供了一条便捷的途径，在节能降耗方面表现出十分明显的优势，特别是处理低碳氮比废水，其优越性更加显著，因而自发现以来一直是国内外研究的热点。

厌氧氨氧化菌是厌氧氨氧化技术的核心，然而由于厌氧氨氧化菌具有如下特点使其在反应器内难以维持较高的生物浓度，直接制约了厌氧氨氧化技术的深入研究和工程化应用 [1] 。一是厌氧氨氧化菌生长十分缓慢，倍增时间长（比增殖速率仅为 0.03 h -1 ，即世代时间长达 11 d），且对环境条件敏感性高(避光、严格厌氧、有机物等)；二是厌氧氨氧化菌生物量较低，反应器启动时间过长；三是在反应过程中持续产生的大量 N 2 使得微生物悬浮于反应器内，容易造成菌种流失。

近年来，国内外学者在厌氧氨氧化菌的微生物学特性方面取得了大量的研究成果，这对于实现厌氧氨氧化菌的快速高效富集培养，进一步推动厌氧氨氧化技术的发展具有十分重要的意义。

1 厌氧氨氧化菌的特性

1.1 厌氧氨氧化菌的发现

早在 1977 年，奥地利理论化学家 Broda [2] 通过化学反应自由能的热力学计算，大胆预言自然界应该存在反硝化氨氧化菌的假设，一种以 NO 3- -N 或NO 2- -N 为电子受体，将 NH 4+ -N 直接转化为 N 2 的自养菌，但此假设一直未得到进一步的证实。直到1994 年，荷兰 Delft 大学的 Vande Graaf 和 Mulder等 [3, 4] 证实了 Broda 的预言，他们在一个处理工业废水的实验室规模的三级自养反硝化流化床中观察到了 NO 3- -N 和 NH 4+ -N 同时消失且成一定的比例，并伴有 N 2 产生的异常现象，他们将其称为厌氧氨氧化。在随后的试验研究中进一步证明了厌氧氨氧化反应实质上是一个发生在微生物体内的氧化还原过程。

1.2 厌氧氨氧化菌的分布及种类

越来越多的文献表明，在海底沉积物、土壤的缺氧层、河底底泥、污水处理厂的活性污泥等多种环境中都有厌氧氨氧化菌存在。据估计，海洋中厌氧氨氧化反应产生的 N 2 量约占全球海洋中 N 2 总量的 30%~50%，可见厌氧氨氧化菌在自然界生态系统的氮素循环中起着举足轻重的作用。1998 年，Strous [4] 等首次采用 SBR 反应器历时 1 年的运行，获得了纯度可达 74%的厌氧氨氧化菌富集产物，最大比活性约 7.5×10 -4 mol-NH 4+ /(kg 蛋白·s)，并通过16S rRNA 技术鉴定厌氧氨氧化菌属于分支很深的浮霉菌门浮霉菌目(Phylum Planctomycetes)。

由于厌氧氨氧化菌生长极其缓慢，只有在高细胞浓度时才能表现出活性，因此采用经典的微生物生态学手段难以对其进行分离鉴定，迄今为止仍未获得厌氧氨氧化菌的纯系菌株。采用现代分子生物学技术—荧光原位杂交(FISH)和 PCR 扩增分析法已经鉴定出 5 个属 9 个种的厌氧氨氧化菌。

1.3 厌氧氨氧化菌的细胞结构

厌氧氨氧化菌属于革兰氏阴性菌，大多呈不规则球状，以出芽方式繁殖。在电子显微镜下发现细胞壁表面均布着火山口形状的凹陷，细胞内有特殊的分区结构。厌氧氨氧化菌的富集培养物主要以生物膜或颗粒污泥的形式存在。由于富含 C 型细胞色素，高浓度富集的厌氧氨氧化污泥通常呈深红色，性状粘稠，在 470 nm 处具有较强的吸收峰。 厌氧氨氧化菌的细胞质内含有一类独特的由单一双分子层（膜）包裹形成的重要细胞器—厌氧氨氧化体（Anammoxsome）。厌氧氨氧化体内含有大量的联氨/羟胺氧化还原酶（HAO），是发生厌氧氨氧化反应的重要场所。它的相对体积很大，约占整个细胞体积的 30%~60%。Margaret 等 [6] 认为厌氧氨氧化菌是由细胞质、细胞膜和细胞壁三部分组成，其中细胞质又被双层膜分隔成厌氧氨氧化体、核糖细胞质（riboplas）以及 pp 质（paryphoplasm）。

1.4 厌氧氨氧化菌的生理特征

厌氧氨氧化菌是一类专性厌氧的化能自养型细菌。其细胞产率较低，在中温（30~35 ℃）厌氧条件下，每消耗 1 g 氨氮只产生 0.088 g 生物质。在35 ℃条件下，在生产性试验反应器中测得厌氧氨氧化菌的世代时间一般为 9~12 d，比生长最缓慢的产甲烷菌的世代时间还要长。 相关研究表明 [7] ，厌氧氨氧化菌最适宜的 pH 值和温度范围分别是 6.7~8.3 和 20~43 ℃，最佳生长条件为 pH=8.0、温度为 40 ℃，此时最大比活性约9.2×10 -4 mol-NH 4+ /(kg 蛋白·s)，对 NO 2- -N 和 NH 4+ -N的亲和力常数都低于 0.1 mg N/L。通常情况下，当温度高于 45 ℃或低于 11 ℃、pH 值大于 9 或小于6.5 时，其活性将完全受到抑制。可见中温、偏碱性的环境比较适合厌氧氨氧化菌生长。

1.5 厌氧氨氧化菌的生化反应机理

Jetten 等 [8] 提出了厌氧氨氧化菌的生化反应模型如图 1 所示。

在生化反应模型中有 3 种关键的功能性酶：亚硝酸盐还原酶(NIR)、联氨水解酶(HH)和联氨氧化酶(HZO)。该生化反应分 3 步进行：（1）在 NIR 的作用下，催化 NO 2- 被还原成 NH 2 OH；（2）在 HH 的作用下，催化 NH 2 OH 将 NH 3 氧化成 N 2 H 4 ；（3）在 HZO的作用下，N 2 H 4 被氧化成 N 2 并产生 4H + 和 4e。同时这 4e 传递给 NIR，开始新一轮厌氧氨氧化反应。 最新研究发现在厌氧氨氧化反应过程中，细胞质中的质子不断被消耗，而厌氧氨氧化体内会产生质子，所以就形成了一个质子梯度，这种梯度会产生化学能，驱动质子由厌氧氨氧化体的内部向外部转移，并借助三磷酸腺苷酶（ATPase）的作用，合成三磷酸腺苷（ATP），在细胞质中被释放 [9] 。

2 厌氧氨氧化菌的富集培养方法

2.1 用于富集培养厌氧氨氧化菌的反应器

由于厌氧氨氧化菌体积非常小（直径为 0.8~1.1 μｍ），在普通生物反应器内富集培养极容易流失。因此，所采用的反应器必须满足以下条件：（1）具有高效的微生物截留性能，保证反应器内有足够的适合长期富集培养和定量分析的的生物量；（2）抗水力负荷和基质浓度负荷冲击能力强，可以长时间稳定运行；（3）尽量避免产生死角区或局部基质浓度过高；（4）必须具有良好的固液传质性能，确保反应底物能够扩散到生物膜或生物絮体的内层；（5）严格厌氧、避光。

目前用于富集培养厌氧氨氧化菌的反应器主要包括序批式反应器（SBR） [5，10, 23, 24，27] 、厌氧序批式反应器（ASBR） [14, 21] 、上流式厌氧污泥床（UASB）[13, 25] 、上流式厌氧生物滤床（UAF） [16] 、生物膜反应器 [15, 17, 20] 、推流式反应器 [18] 、气提式反应器 [19] 、流化床反应器 [4] 、固定床反应器 [11] 等。 Wouter 等 [10] 以厌氧氨氧化颗粒污泥为接种污泥，在膜生物反应器中成功富集出纯度约为 97.6%的具有厌氧氨氧化活性的微生物，厌氧氨氧化菌在培养液中处于悬浮均匀分布的状态，倍增时间仅为5 d。Toh 等 [11] 采用固定床反应器接种澳大利亚污水处理厂的市政污泥，经过一年的富集筛选，在载体上面成功培养出大量桃红色的厌氧氨氧化菌约占88%的生物膜。

朱静萍等 [12] 采用 SBR 反应器接种硝化污泥，经过 142 d 的驯化培养，于较高负荷下成功地富集了厌氧氨氧化菌。在稳定运行阶段,反应器的 TN 容积负荷达到 0.43 kg N/（m 3·d），TN 去除率最高为93.3%，平均达到 80.5%；NH 4+ -N 与 NO 2- -N 去除率则分别达到 93.9%和 99.8%。污泥性状发生较大变化，厌氧氨氧化菌大量增殖。 周少奇等 [13] 采用 UASB 反应器接种城市污水处理厂污泥浓缩池的污泥，反应器运行 160 d 时，在反应器的下部形成了肉眼可见的具有厌氧氨氧化活性的褐色颗粒污泥，与文献报导的厌氧氨氧化颗粒污泥为红色不一致。顺着水流方向，由下自上污泥逐渐细碎。整个富集培养过程中，未发现污泥的流失现象，不断有气泡从污泥中冒出。

李金堂等 [14] 以厌氧颗粒污泥作为 ASBR 反应器的接种污泥，经过 55 d 驯化后，第一次出现厌氧氨氧化菌活性迹象；在第 85 d 时候，厌氧氨氧化菌成为优势茵种；在第 140 d 时候，反应器运行稳定，NH 4+ -N 与 NO 2- -N 去除率分别为 60.5%和 63%，污泥颜色由灰色变成红棕色。 李祥等 [15] 为了防止菌种流失，向 ASBR 反应器中投加吸附性较好的纤维膜(无纺布)作为厌氧氨氧化菌的载体,将其改造成厌氧序批式生物膜反应器(ASBBR)。在培养过程中，污泥颜色逐渐由灰色变为红棕色，最终变为浅红色。第 132 d 时, 反应器TN 容积去除负荷达到 2.060 kg N/（m 3·d）。整个过程中，NH 4+ -N 与 NO 2- -N 去除率一直保持在 98%以上。

李军等 [16] 采用 UAF 反应器接种普通厌氧污泥成功实现了厌氧氨氧化反应器的快速启动。连续运行约 156 d 后，NH 4+ -N 与 NO 2- -N 去除率分别达到50%和55%，NH 4+ -N与NO 2- -N容积负荷达到0.72 kg N/（m 3·d）。在反应器的下部形成了棕红色颗粒状污泥，与接种的黑色污泥有明显不同。 陈胜等 [17] 采用悬浮填料填充床生物膜反应器，接种城市污水处理厂二沉池污泥并采用好氧预挂膜低负荷培养法来驯化培养厌氧氨氧化菌群。试验研究表明，好氧预挂膜低负荷培养法在较短时间内(大约 90 d)就可以完成厌氧氨氧化反应器的快速启动。在稳定运行阶段，NH 4+ -N 与 NO 2- -N 去除率均接近 100%，TN 去除率超过 75%。 刘寅等 [18] 采用两级推流式固定化絮体生物反应器接种好氧活性污泥，成功富集培养出高活性的厌氧氨氧化菌。在稳定运行阶段，NH 4+ -N、NO 2- -N和 TN 平均去除率分别为 99%、98%和 85%，TN 去除负荷最高可达 2.56 kg N/（m 3·d）。反应器内具有厌氧氨氧化活性的污泥有红色颗粒污泥和棕褐色絮状悬浮污泥这两种形态。

林丰妹等 [19] 利用气提式内循环反应器经过大约45 d 的时间，成功富集培养出了好氧硝化颗粒污泥。在保证 HRT 不变的前提下，通过逐步提高进水NH 4+ -N 浓度来提高反应器的容积负荷，培养出的好氧硝化颗粒污泥不仅可以进行好氧氨氧化反应，将其置于厌氧条件下培养一段时间以后，也同样具有厌氧氨氧化活性。

2.2 用于富集培养厌氧氨氧化菌的接种污泥

菌种是生物反应器的核心，接种污泥的选取对于厌氧氨氧化菌的富集培养培起着至关重要的作用。由于厌氧氨氧化菌在自然界中广泛存在，所以利 用 不 同 的 污 泥 作 为 接 种 物 均 能 成 功 启 动NAMMOX 反应器。目前普遍认为成熟的厌氧氨氧化污泥是最好的接种污泥 [10，20] ，除此之外好氧污泥[21, 24] 、厌氧颗粒污泥 [21, 23] 、硝化污泥 [20] 、反硝化污泥[22] 、厌氧消化污泥 [21, 24] 、河底污泥 [25] 等与有氮素转化功能的污泥也是良好的接种污泥。此外，也有一些研究者将上述几种污泥的混合污泥作为富集培养厌氧氨氧化菌的接种污泥 [25-27] 。

黄勇等 [20] 采用 2 套相同的上流式生物膜反应器（UBF）分别接种少量厌氧氨氧化污泥和大量硝化污泥，经过 114 d 的运行，前者的氮去除速率由 0.23 kg N/(m 3·d)提高至 5.29 kg N/(m 3·d)，总氮去除率达到89%以上；后者的氮去除速率由 0.01 kg/(m 3·d)提高至 1.1 kg/(m 3·d)，TN 去除率达到 84.6%以上。在相同时间内，接种少量的厌氧氨氧化污泥比接种硝化污泥能更快地实现厌氧氨氧化菌的富集。 路青等 [21] 采用 3 套相同的 ASBR 反应器分别接种硝化污泥、厌氧颗粒污泥和厌氧消化污泥，分别经过 61 d、70 d 和 85 d 的运行均获得了厌氧氨氧化菌的富集培养物，NH 4+ -N 去除率分别为 82%、92%和 91%，TN 去除率达 76%、82%和 80%。试验结果表明，硝化污泥呈絮状但沉降性比接种前好，厌氧颗粒污泥解体后最终形成粒径集中在 0.5~1.0 mm的污泥，厌氧消化污泥则呈沙化状态，有细小颗粒出现。 张蕾等 [22] 采用将竹炭作为载体的厌氧氨氧化膨胀床反应器接种反硝化污泥，用模拟废水成功实现了厌氧氨氧化菌的富集培养。随着反应过程的推进，装置内的污泥性状逐渐从深黄色絮状污泥转变成棕灰色颗粒污泥和红色颗粒污泥。红色颗粒污泥的厌氧氨氧化活性可达 0.56 mg TN/(mg protein)/h，是棕灰色颗粒污泥的 8 倍，由此推断红色颗粒污泥是厌氧氨氧化功能的主要承载者。

赵志宏等 [23] 在 SBR 反应器中接种厌氧颗粒污泥富集培养厌氧氨氧化菌。控制 HRT=30 d，经过 54 d的驯化后，出现厌氧氨氧化现象，污泥由灰黑色变为棕褐色，粒径减小；到第 90 d 时，NH 4+ -N 和NO 2- -N 的最高去除速率分别达到 14.6 g N/(m 3·d)和6.67 g N/(m 3·d)。从第 110 d 开始，逐步降低 HRT。到 156 d 时 HRT=5 d，NH 4+ -N 和 NO 2- -N 去除率分别为 60.6%和 62.5%，TN 负荷达到 34.3 g N/(m 3·d)，反应器中形成的红棕色颗粒污泥已经具有相当高的厌氧氨氧化活性。

袁怡等 [24] 采用 SBR 反应器分别接种好氧污泥和厌氧消化污泥，在相同条件下，均能培养出具有厌氧氨氧化活性的污泥，但是后者比前者的筛选效果好，所需时间短。厌氧污泥采用厌氧筛选法时，在pH=8.0、温度为 35 ℃时筛选效果最佳，用时 67 d；而采用好氧筛选法时，只需短短 20 d。

沈平等 [25] 采用 2 套小试 UASB 系统分别接种厌氧颗粒污泥与好氧活性污泥的混合污泥和清华大学校园的河底污泥，经过 320 d 和 246 d 的运行，均成功实现了厌氧氨氧化过程。NH 4+ -N 去除率分别达到 95%和 81%，NO 2- -N 去除率分别为 99.4%和88.5%。污泥性状发生了比较明显的变化，接种混合污泥的反应器中富集培养出了厌氧氨氧化颗粒污泥。

唐崇俭等 [26] 以 50%短程硝化污泥、20%厌氧絮体污泥、20%硝化反硝化污泥和 10%厌氧颗粒污泥混合污泥作为接种污泥，在常温(5~27 ℃)条件下，经过 255 d 的运行，成功启动了中试规模的厌氧氨氧化反应器，最终容积氮负荷为 1.50 kg N/(m 3·d)，基质氮去除速率可达 1.30 kg N/(m 3·d)。通过向反应器中一次性投加少量厌氧氨氧化污泥(投加比 2%)，可大大加快厌氧氨氧化菌的富集进程。

林剑波等 [27] 采用 3 组平行的 SBR 反应器分别接种厌氧颗粒污泥与好氧活性污泥的混合污泥、河底污泥与好氧活性污泥的混合污泥以及厌氧消化污泥与好氧活性污泥的混合污泥，在相同运行环境下同时运行 150~180 d 均成功启动了厌氧氨氧化反应器，NH 4+ -N 去除率分别达到 88%、80%和 85%，NO 2- -N 去除率均达到 96%以上。但厌氧消化污泥与好氧活性污泥的混合污泥的启动周期更短，更加适合厌氧氨氧化菌的快速富集。

3 结束语

目前国内外学者在厌氧氨氧化菌的富集培养方面进行了大量的研究，但仍处于实验室规模阶段，这也是制约厌氧氨氧化技术未能在工程实践中得到广泛应用的一个关键性因素。从微生物的角度来讲，应加强以下两个方面的研究：（1）改进微生物学研究方法，深入研究厌氧氨氧化菌的微生态特征以及从无机环境向有机环境过渡过程中微生物菌群的变化规律；（2）进一步研究厌氧氨氧化菌在不同环境中的生理特性及其代谢酶的特性，探寻提高其增殖速度的途径。

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