陈伟东 温东辉∗

（北京大学 环境科学与工程学院,北京 100871)

研究背景

纵观人类历史,水对文明的发展起着至关重要的作用。由于人口增长和社会经济活动的增加,全球用水量和排水量不断增加。污水处理厂(wastewatertreatment plants, WWTPs) 成为现代城市中不可缺少的基础设施,一个多世纪以来,以活性污泥法为核心技术的生物处理法已成为处理城市污水和工业废水最经济有效的方法。污水生物处理系统含有高度复杂的微生物群落,它们在污染物分解和去除中发挥着重要作用,利用分子生物学和微生物信息学技术,已揭示其多样性和结构对污水处理性能(如营养物去除、污泥膨胀等)有直接影响。

探索微生物时空分布或生物地理分布规律一直是环境微生物生态学研究的目标和挑战。微生物时空分布规律从最初在大型生物上的研究,扩展到自然生态系统微生物群落,近年来在工程系统中逐渐得到应用。其中,分类群-面积关系、分类群-时间关系和距离衰减效应等已在污水处理系统的微生物群落分布中得到验证。随着研究的发展,微生物时空分布研究已从分布规律的发现和描述,逐渐拓展到微生物的群落构建过程和共存网络模式,以及微生物时空分布与生态系统功能的关联。近百年来,生物群落构建机制一直是生态学的核心问题之一,为解释该机制,生态学家、地理学家提出了大量的理论、假说和模型。其中,最被人广泛接受的是生态位理论和中性理论。经过不断争论,现在普遍认为群落构建受到确定性过程和随机过程的共同作用,生态位理论和中性理论的相对贡献和融合发展已成为群落生态学的研究前沿热点。

由于微生物培养方法的局限性,早期污水处理系统微生物多样性和时空分布研究的发展十分缓慢。进入21世纪以来,特别在 2010 年以后,随着大规模高通量测序技术的迅速发展及其在生态学研究中的应用,以及土壤等自然生态系统微生物生物地理学的发展成熟,污水处理系统微生物群落多样性和时空分布格局逐渐受到各国家特别是中国科学家的关注(图 1)。如 Wu等揭示了全球污水处理厂细菌多样性和生物地理分布规律,预测了全球活性污泥系统中细菌有(1.1±0.07)×109种,发现细菌群落遵循距离-衰减效应、种-丰度分布等宏观生态模式。Zhang 等分析了中国15个城市污水厂活性污泥细菌的生物地理和构建模式,发现确定性过程对细菌群落构建的贡献大于随机过程。这些研究从生态学角度更深入地了解活性污泥微生物群落。作为1个微生物发挥重要作用的功能系统,科学家更多关注污水处理厂中的功能菌群,如厌氧氨氧化菌的群落结构及多样性。相对于自然生态系统,污水处理系统微生物群落多样性和时空分布的研究仍然有限(图1a) 。作为典型的人工系统,污水处理系统具有相对可控的设计和明确的运行参数,是研究微生物生态问题的理想环境。将微生物生态学理论融入污水处理厂的设计和管理中非常重要,这将有助于了解污染物处理的作用机理,优化污水处理工艺性能和稳定性,更好地预测活性污泥微生物群落结构应对不同环境和空间的变化,为污水厂运行提供预警,从而完善其管理措施。迄今为止,已有许多环境因素被认为对污水处理性能和微生物群落结构有重要影响,如处理工艺、环境参数、进水废水的特性和操作条件等。本文梳理了污水处理系统微生物时空分布规律和构建机制的研究进展以及国际研究前沿,强调了将微生物生态理论与污水处理工程实践相结合的重要性,并展望了未来的发展趋势及挑战。

摘  要

探索微生物群落时空分布和构建机制一直是环境微生物生态学研究的目标和挑战。近年来,微生物生态学规律和理论逐渐在工程系统中得到应用,分类群-面积关系、分类群-时间关系和距离-衰减效应等规律已在污水处理系统的微生物群落分布中得到验证。随着研究的发展,微生物时空分布研究已从群落分布规律的发现和描述,拓展到驱动群落分布的因素,即群落构建机制的探索。介绍了污水处理系统微生物群落时空分布规律和构建机制的研究进展,并对未来的方向进行了展望,强调了将生态理论和工程实践相结合的重要性。未来应在污水处理系统核心微生物研究、微生物群落的生物多样性、构建机制与污水处理性能的关联、多组学技术在微生物时空分布和构建机制研究中的应用等方面有所突破。

01

污水处理系统微生物群落时空分布规律

1. 种-丰度分布

种-丰度分布(species-abundance distribution, SAD)是对群落中不同物种丰度(观察到的个体数量)的描述,是最古老和最普遍的生态规律之一,其特点是大部分物种丰度较低,只有少部分物种丰度较高,是研究群落优势种和稀有种的重要规律,SAD是生物多样性理论和宏观生态学的核心,旨在了解跨空间和时间尺度的丰度、分布和多样性模式,近年来在微生物生态学中逐渐得到应用。污水处理系统中微生物群落稀有种多样性高,优势种多样性低已经在很多研究中得到证实了解微生物群落种-丰度分布规律有助于解析群落构建机制和生态系统功能。Mcgill等将SAD模型总结划分为5大类:purely statistical(纯统计模型)、branching processes(分枝过程模型)、population dynamics(种群动态模型)、niche partitioning(生态位分化模型)和spatial distribution(空间分布模型),包括了超过40个不同的小模型。模型分类上存在重叠,如中性模型(neutral model)属于种群动态模型,也属于分枝过程模型。将研究数据和生态理论联系在一起会产生各种各样的统计学问题,将对观察到SAD的形状和结果产生影响。和宏观生态学研究中所发现的一样,微生态研究中采样的样本量、采样的时间尺度、空间尺度等,都会影响SAD模式和过程。目前关于SAD模型的拟合效果仍然存在争议,使用哪种模型最好取决于所研究的问题。另外,不同于宏观生态学研究可以对生物个体进行绝对定量,微生物的“种-丰度”分布格局研究主要依赖序列水平(如16S rRNA序列)的相对丰度分析,而相对丰度不等于样本中的细胞数量,它和绝对量与物种的关系在特定条件下会有显著差异。这2个方面是未来研究需要面对和改进的问题。

目前对活性污泥微生物群落种-丰度分布曲线的研究极少。Wu等利用全球活性污泥细菌群落数据分析了常见的SAD模型曲线,包括Poisson lognormal(泊松对数正态模型)、log-series(对数系列模型)、Broken-stick(断棒模型)和Zipf模型,发现泊松对数正态模型解释了活性污泥细菌种-丰度分布99%的变化,能最好地解释观测到的SAD,这与之前全球范围来自环境、工程和宿主相关生态系统超过20000个样本的研究一致。尽管可用的SAD模型很多,如Broken-stick(断棒模型)预测了物种间丰度的高度相似性,因此是预测SAD最均匀的形式之一,Zipf分布是一种幂律模型,是预测SAD的最不均匀形式之一。但对数正态(lognormal)和对数系列(log[1]series)在预测SAD方面是最有效和成功的方法。虽然对数系列模型得到了宏观生态学研究的充分支持,但泊松对数正态模型更适用于微生物研究。

2. 距离-衰减关系

距离-衰减关系(distance decay relationship, DDR)研究不同样点的群落组成相似性随样点间地理距离的变化而变化的规律,是一种普遍存在的生物地理学模式。微生物分布是环境因素(光照、降水、温度、pH等)和历史进化因素(距离分隔、物理屏障、扩散限制和过去环境的异质性等)综合作用的结果。首先,环境条件可驱动距离-衰减效应,环境因素是空间自相关的,会随着距离的变化而变化,环境因素的差异会选择具有不同生态位偏好的微生物,导致微生物群落组成的差异,这就是荷兰微生物学家Baas-Becking提出的著名生物地理学假说“微生物可能无处不在,但环境会对它们进行选择(Everything is everywhere, but, the environment selects)”。其次,距离-衰减也会受到历史进化因素的影响,即使微生物群落不受环境条件的影响,也可以产生距离-衰减效应。当代环境条件与历史进化因素对于距离-衰减的相对贡献仍存在争议,主要与生态系统类型、研究尺度、微生物类群、个体大小以及研究技术手段等相关。

距离-衰减在自然生态系统中的动植物和微生物群落分布中广泛存在,与自然生态系统类似,污水处理系统的微生物群落分布也存在距离-衰减效应。Wang等利用功能基因阵列(GeoChip 4.2)对中国10个城市26个污水处理厂功能微生物群落的研究发现,不同微生物功能类群存在显著但微弱的距离-衰减关系,且这种关系由环境异质性和地理距离共同驱动,表明距离相近比相距较远的污水厂具有更相似的微生物功能基因群落组成。Wu等发现活性污泥细菌群落在局域、区域和全球空间尺度上都存在显著的距离-衰减效应,且不同尺度的衰减程度不同,其中,洲际内(区域尺度)>跨洲际(全球尺度)>城市内(局域尺度),且活性污泥细菌群落和土壤、沉积物这类非流动性的生境具有类似的空间周转率。

3. 分类群-面积关系

分类群-面积关系(taxa-area relationship, TAR)描述了在一定地域内物种多样性与面积之间的函数关系,是群落生态学研究的1个基本问题。利用分类群-面积关系可估算区域的分类群数量、评价区域生物多样性的丧失。由于构建方式、尺度效应以及区域差异,分类群-面积关系的具体形式及其普适性还存在争议。分类群-面积关系可用公式S=cAz表示,式中,S为分类群数目,A为面积,c和z为常数。利用分类群-面积关系,可以预测微生物群落多样性随着反应器面积的变化关系。一般来说,反应器面积更大,能提供更丰富的营养物质,相应的微生物多样性也越高,系统功能更加稳定。

目前针对污水处理系统微生物群落分类群-面积关系的研究有限。有研究发现膜生物反应器(membrane bioreactors, MBR)内细菌群落分布呈现分类群-面积关系,随着MBR体积增加,细菌个体数量和多样性增加,群落结构的均匀度成比例增加。这是因为MBR体积越大,细菌具有更大的生存空间和更宽可利用的生态位;相反,MBR体积越小,会导致只有小部分占优势地位的细菌能够定殖。另外,Valentín-Vargas等对不同尺寸生物反应器中的微生物群落进行1年的时间序列分析,发现大的生物反应器中微生物群落变化最小,结构最稳定,且效率更高,污水处理厂的平均运营成本随着反应器面积的增加而降低。同时,该研究认为岛屿生物地理学模型背后的生态学理论和分类群-面积关系可用来预测反应器细菌群落构建。单个污水厂类似于1个“岛屿”,更大的污水厂具有更高的生物多样性,性能也更稳定。理论生态学研究在污水处理厂设计和运行中具有重要的指导作用,它可预测微生物群落组成及结构的变化,为系统性能和运行条件的联系提供证据,这对于环境工程师和微生物生态学家非常重要。有证据表明,污水处理厂的生物学行为就像复杂的生态系统,与水生生态系统一样存在食物链,污水处理系统中的生物主要是由细菌、古细菌、真菌、病毒和原生动物组成的多样化群落。进入的废水污染物以溶解态和颗粒养分的形式为污水处理系统提供食物和资源,推动微生物群落的生长和繁殖,然后受到原生动物和其他消费者的捕食,产生的生物固体通过沉降或过滤从系统中物理去除。因此,微生物群落的大小和物种组成同时受到废水进水的供应速率和组成、捕食以及常驻生物之间复杂的相互作用的调节。另外,有研究正努力将生态理论纳入其他工程环境,包括污染物生物降解。如Graham等和Röling等使用资源比率理论(resource-ratiotheory)作为理论框架,试图预测资源供应和供应比率对碳氢化合物污染物降解率的影响。研究表明,资源比率理论有助于预测生态系统功能,且明确定义的生态框架确实可应用于工程实践。

4. 分类群-时间关系

分类群-时间关系(taxa-time relationship, TTR)反映分类群多样性随时间的变化关系。从进化的角度来看,群落发展的时间越长,累积的多样性也会随着调查时间(或进化时间)不断增加,这种时间累积对分类群多样性的影响称为分类群-时间关系。在污水处理系统中表现为:一定时间内随着反应器运行时间的增加,微生物累积多样性越高。借鉴分类群-面积关系,分类群-时间关系可用幂律公式S=cTw来表示,式中,S为分类群多样性,c为常数,T为时间,w为分类群-时间关系的幂律指数,反映群落的周转率。了解污水处理系统的分类群-时间关系,可预测微生物群落多样性随反应器运行时间的变化情况。

已有许多研究显示污水处理系统微生物群落存在分类群-时间关系。Van der Gast等使用16S rRNA gene和DGGE评估了添加不同工业废水浓度的生物反应器中细菌群落在时间上的变化,发现在154d内,随着时间的推移,细菌群落累积丰富度不断增加。同时,随着工业废水浓度(选择压力)增加,细菌分类群-时间关系的变化率(斜率)和群落周转率降低,环境选择作用增强,群落由受随机过程影响逐渐转变为受确定性过程影响。另外,Hai等使用16SrRNAgene测序技术对实际生物反应器和实验室生物反应器的活性污泥细菌群落动态进行1年多的时间序列分析,发现细菌累积的丰富度随反应器运行时间的增加而增加。2种生物反应器(实际活性污泥反应器,幂律指数w=0.43;实验室规模生物反应器,w=0.55)及13个不同的细菌门(w=0.32~0.57)的幂律指数不同,且优势类群的幂律指数普遍高于稀有类群,表明不同的生物反应器和不同丰度的细菌门具有不同的时间周转率。Kim等采用454焦磷酸测序法对连续运行2年内每2个月采集的活性污泥样品中的16S rRNA基因进行时间序列分析,发现活性污泥生物反应器中general和rare细菌类群在时间动态模式上差异明显,rare细菌类群比general细菌类群表现出更高的多样性和更剧烈的波动;在一定时间内,随着反应器运行时间的延长,活性污泥累积的微生物多样性越来越高。

02

污水处理系统微生物群落构建机制及其影响因素

1. 污水处理系统微生物群落构建机制

随着研究的发展,微生物生物地理学已从微生物群落分布规律的发现和描述,拓展到微生物群落的构建机制、共存网络及微生物地理分布与生态系统功能的关联。生态位理论和中性理论是微生物群落构建机制最被人广泛接受的理论。生态位理论认为:确定性因素(如物种性状及竞争、捕食、互利共生等微生物间相互作用)和环境条件(如pH、温度和营养盐)控制着群落构建,被称为确定性过程(deterministic processes)。相反,中性理论则认为随机过程(stochastic processes),包括物种的出生、死亡、迁移、扩散或历史偶然性(如殖民顺序)等过程塑造生物群落。现在研究人员普遍认为群落构建受到确定性过程和随机过程的共同作用,其作用的相对大小取决于多种因素。

分析方法在解析生物地理分布格局中有着决定性作用。目前,在污水处理系统中研究微生物群落构建机制的分析方法主要有方差分解 ( variation partitioning analysis, VPA )、 中性群落模型(neutral community model)和零模型(null model)。同时,随着研究的发展,出现了新的定量评估生态随机性的方法,如 Ning 等提出了标准化随机率(normalized stochasticity ratio, NST) 来定量评估不同情形下的生态随机性。每种方法都有其适用性和优缺点,准确区分生态随机性和确定性环境因素引起的干扰十分困难,为避免研究结论的片面性,深入了解方法原理,用不同方法根据研究的特点综合分析是必要的。

近年来,自然生态系统微生物群落多样性和构建机制已经有大量研究,如土壤、海洋、河流、水库、红树林沉积物,涉及微生物包括细菌、古菌、真核微生物、原生生物(硅藻、丝足虫、纤毛虫、有壳变形虫)等。如Chen等利用中性群落模型揭示了随机过程主导湿季和干季亚热带河流微型真核浮游生物群落构建,且随机过程对湿季微生物群落的相对贡献更大。同时,该研究发现干季微生物群落的距离-衰减效应更强,且稀有种和优势种具有相似的地理分布格局。Chen等利用中性模型、零模型和网络分析方法揭示了红树林沉积物中细菌、古菌群落构建和共存网络模式,发现相对于古菌,细菌群落受随机过程的影响更强,且网络结构更复杂。

相对于自然生态系统,污水处理系统微生物群落构建机制研究还非常有限。Ofiţeru 等利用T-RFLP 技术和中性群落模型 (neutral communitymodel)解析了污水处理厂活性污泥厌氧氨氧化细菌的群落构建,发现迁移、随机繁殖等是决定微生物群落相对丰度的主要驱动因素。Zhou 等以微生物电解槽反应器作为模式系统证明随机过程不仅决定功能微生物群落结构,而且在决定生态系统功能方面起主导作用。Sun 等使用新开发的工具iCAMP(infer community assembly mechanisms by phylogeneticbinbased null model) 研究了活性污泥中不同微生物群落的构建机制,发现随机过程主导活性污泥微生物群落,其中漂变(drift) 占最大比例(52.8%) ,而同质选择(homogeneous selection,18.2%)是最重要的确定性过程。但也有研究表明确定性过程主导着活性污泥微生物群落构建。如 Yu 等选择位于马来西亚的纺织工业污水厂,对 410 份活性污泥样品微生物群落进行了群落构建和功能的时间动态分析,发现系统稳定时确定性过程(占比56.1%~100%)主导微生物群落构建。如废水特性、操作参数和地理位置对活性污泥细菌群落变化也有影响, 另外, Wang等表明废水特性(占比 25.7%) 、操作参数( 占比23.9% )和地理位置(占比 14.7%) 能同时影响活性污泥细菌群落结构。因此,确定性过程和随机过程哪方在生态系统中起主导作用是饱受争议的问题,其相对重要性受到如生物处理系统类型、 研究尺度、环境参数和操作条件等因素的影响。表1 总结了近年来污水处理系统微生物群落构建机制的代表性研究。

2.  污水处理系统微生物群落构建影响因素

1）时空尺度

尺度效应在生态学理论和工程实践上都相当重要,是微生物生态学研究中必须考虑的关键问题。自然生态系统的所有格局与规律都具有尺度依赖性,这一规律在工程系统中同样存在,研究人员观察到的污水处理系统微生物时空分布规律均建立在特定的时间、空间尺度和分类尺度上。尺度研究具有复杂性、变异性特征,不同的研究尺度导致微生物群落构建机制出现差异。时空尺度可分为时间尺度和空间尺度。空间尺度可以简单区分为大尺度、中尺度和小尺度,也可以根据具体的研究范围划分为微小尺度、局域尺度、区域尺度、洲际尺度、全球尺度等。不同空间尺度下由于环境和地理因素的差异,微生物的分布特征可能不同。

与自然生态系统的规律类似,空间尺度也会影响污水处理系统微生物群落构建。全球尺度的研究表明,尽管活性污泥是人为控制的生态系统,但它的细菌群落组成很可能是扩散和漂变等随机过程驱动的。也有人发现了相反的现象,如Zhang等对中国北部、中部、东部和南部的60个污水厂进行大尺度分析,发现确定性过程主导活性污泥细菌群落构建,其中年平均温度是影响微生物群落结构的最重要因素,空间尺度及采样规模也会影响活性污泥微生物群落构建。

时间尺度上的研究跨度可从小时、天、月到季节、年乃至更长时间。有研究采用功能基因芯片GeoChip和Illumina Miseq测序研究城市污水处理系统中微生物群落功能基因和分类学多样性,分析了短期12d和中期12周内平行运行的膜生物反应器(membrane bioreactors,MBR)和氧化沟(oxidation ditch,OD)系统的微生物时间动态变化规律,MBR和OD系统的微生物群落结构呈天、周变化。2个系统的微生物群落功能基因天变化率高于周变化率,微生物群落在较短的时间尺度内变化更快,可能原因是微生物群落在长时间内表现出生态恢复力。在决定性影响因素中,短期内操作参数——MLSS和DO浓度影响MBR和OD系统微生物群落结构;中期内进水基质浓度(COD、TN和TP浓度)和温度影响微生物群落结构。另外,分子生态网络分析显示短期的核心碳、氮、磷循环功能基因与中期的核心微生物的分子生态网络拓扑性质、节点组成和具有重要生态学意义的节点组成均有所不同。结果表明,时间尺度影响微生物群落结构进而影响其构建机制。关于污水处理系统时间尺度的研究有限,未来应加强这方面特别是长时间和多样品数量的研究工作,更全面地认识群落的动态变化水平和生态学规律。

2）环境条件和运行参数

环境参数可改变确定性和随机性的相对重要性,从而改变群落构建过程。Zhang等分析了中国15个城市的58个污水处理厂的活性污泥细菌群落,结果表明,污水的可生物降解性影响细菌群落构建。进水可生物降解性(生物需氧量BOD/化学需氧量COD,即B/C)影响微生物群落结构,进而影响污水处理性能。当B/C过高或过低时,会导致微生物多样性低、随机过程作用强、微生物网络复杂度高,导致污染物去除负荷低。当B/C约为0.5时,系统稳定性和处理效率最佳。

运行参数对微生物群落构建有重要影响。曝气池是污水厂的1个重要工艺段,利用活性污泥法进行污水处理,池内提供一定的污泥停留时间(sludge retention time,SRT),满足好氧微生物所需的氧量以及使污水与活性污泥充分接触的混合条件,使微生物可以最大效率地进行有氧呼吸,降解污水中的有机物。Sun等对不同SRT条件下运行的48个污水处理厂曝气池中的144个活性污泥样品进行检测,结果表明,SRT对曝气池微生物群落的多样性、组成、构建机制和相互作用有显著影响;当SRT为10~20d时,曝气池中的微生物群落具有生物多样性高、随机过程影响低、共存网络结构稳定、丝状污泥膨胀风险低和脱氮潜力高的特点。在这种SRT条件下,曝气池运行时微生物群落更稳定,对外界干扰的抵抗能力更强。Yuan等在8个不同的SRT(1~15d)下运行反应器,发现SRT为15d和

3）其他因素

除时空尺度、环境因素和运行参数外,确定性和随机性过程的相对重要性还受到物种的相对丰度和出现频率、进水、出水不同处理阶段等因素的影响。

物种的相对丰度和出现频率影响确定性和随机性过程的相对重要性,主要原因在于不同的微生物类群对环境和空间因素的变化具有不同响应。Jiang等揭示了石油化工活性污泥优势稀有微生物群落的构建模式,将OTU的相对丰度>0.1%类群的菌种划分为优势种,相对丰度

0.05%的类群,稀有种是平均相对丰度

如Hou等对位于重庆和厦门的13个污水厂进行研究,发现确定性过程塑造栖息地出现频率较低的类群(Specialists),随机性过程塑造栖息地出现频率较高的类群(Generalists)。

Hou等发现污水厂进水和出水中,微生物群落构建机制的相对重要性也会发生变化。他们对中国5个污水厂进行研究,发现确定性过程(homogeneous selection)主导进水到出水过程中的原核生物群落构建,且确定性过程的相对重要性在不同优势类群之间存在差异,Bacteroidetes>Proteobacteria>Gammaproteobacteria>Firmicutes>Betaproteobacteria,而随机过程(dispersal limitation)主导出水原核生物群落构建。Niederdorfer等发现厌氧氨氧化生物膜发育的3个不同阶段(定殖、演替和成熟阶段),随机和确定性过程在调节生物膜内的微生物群落结构的相对重要性发生变化。如在生物膜微生物定殖的最初阶段,群落构建由随机过程驱动,并且定殖的类群成功地成为生物膜核心群落的一部分。在定殖的第2、3阶段,由于竞争加剧,确定性过程的相对贡献增加,同时,群落迁移率下降,稳定性增强,群落组成中厚壁菌门(Firmicutes)多样性减少,绿弯菌门多样性(Chloroflexi)增加。研究表明:只改变反应器条件难以加速或调节生物膜的形成,随着时间推移,生物膜内部的群落构建机制在塑造微生物群落中起着关键作用。因此,深入解析厌氧氨氧化生物膜中的微生物群落构建对于更好地理解和调控生物膜的发育和形成过程至关重要。

3.  微生物共存网络

在环境中,微生物并不是以分离的个体形式存在,而是通过直接或间接的相互作用形成复杂的共存网络。网络分析能够揭示微生物中非随机的物种共存模式,提高对微生物群落的构建机制的理解。同时,网络分析提供了一种识别群落中关键类群(Keystone taxa)的方法。关键类群是一类在生态系统中高度关联的,对微生物群落结构和稳定性起独特而关键的作用(如参与废水中污染物的分解),且不因时空变化而改变的类群。如Dai等利用网络分析揭示了受人为影响的海湾中细菌群落的关键类群,发现这些类群受到N污染物的强烈影响。Chen等发现细菌和古菌群落中一些低丰度类群(条件稀有种)属于关键种,表明低丰度类群对网络结构和稳定性有显著贡献。Tang等开发了一种三元微生物环境网络(tripartite microbial-environment network,TMEN)分析方法,将微生物丰度、代谢功能和环境数据整合为1个三元网络来研究微生物的综合生态效应,并应用TMEN分析了我国污染最严重的沿海地区之一——杭州湾沉积物中的微生物环境群落结构,发现硝化螺旋菌目(Nitrospirales)细菌和Methanimicrococcus甲烷微生物属于关键类群。关键类群或核心类群的定义有多种方法,网络分析只是其中的一种。如Wu等根据OTU丰度和出现频率对群落中的核心类群进行了严格定义,约0.05%(28个OTUs)被定义为全球活性污泥核心OTUs,并发现这些OTUs在污水BOD、COD、TN等的去除中发挥重要作用。培养核心细菌对于了解它们的遗传、生理、系统发育以及提高污水处理厂的性能至关重要。对这28个核心OTUs进行深入分析,Song等成功分离出活性污泥核心菌株(Casimicrobium huifangae),并发现该菌具有矿化多种碳源(包括碳水化合物、芳香族化合物和短链脂肪酸),还原硝酸盐和积累聚磷酸盐的能力,是活性污泥微生物网络中重要的模块枢纽,具有重要的污水处理效能。尽管一些理论研究已经探讨了网络属性对生态系统稳定性的影响,但仍缺少实验证据,网络推理算法能否正确识别关键物种,需要实验验证。另外,在计算网络间的相关性时,有不同的统计方法,包括Spearman、Pearson相关系数网络、SparCC、局部相似性分析(local similarity analysis,LSA)、随机矩阵理论(Random Matrix Theory)等。不同方法会对结果产生影响,应该根据研究实际选择合适的分析方法。

表2总结了近年来污水处理厂微生物群落相互作用关系的代表性研究。Zhang等指出,微生物共存网络分析有助于揭示污水处理厂中微生物群落以及各种环境变量对微生物群落形成的贡献,有助于理解微生物参与的污染物去除规律。Ju等研究了全球污水处理厂活性污泥细菌群落分布,利用Spearman相关性的微生物共存网络分析表明,活性污泥中细菌群落相互作用塑造群落结构。同时,Ju等对1个城市污水处理厂的活性污泥细菌群落进行长时间观测,发现5年内细菌群落的动态没有明显的季节性演替,基于Spearman相关性的网络分析表明,微生物相互作用是决定细菌群落组成的主要驱动因素。Jiang等利用网络分析对活性污泥中的细菌群落进行392d的时间动态分析,发现活性污泥微生物群落结构只有微弱的季节性变化。此外,在污泥膨胀和泡沫形成的开始、持续和消退过程中,发现了大量快速周转的菌群。对这些特定的菌群及其相关的环境因素的认知可能为处理污泥膨胀和泡沫等问题提供解决的线索。污水处理系统中营养物质是网络结构的重要驱动因素,环境条件如COD浓度的变化,可促进网络结构的动态变化。如Sun等比较了进水和活性污泥的网络结构,发现不同季节进水微生物网络比活性污泥微生物网络变化更大,原因在于不同季节进水COD浓度变化较大。随着时间推移,活性污泥网络比进水网络具有更稳定的季节性拓扑参数,这可能是由于活性污泥微生物群落具有稳定的功能而导致群落结构和生态网络更为稳定。需要指出的是,大多数用于推断共存网络的计算方法尚未使用实际的数据集进行评估,这使得研究人员只能猜测网络分析的重要特性,如敏感性、特异性、精确度等。因此该方法存在一定的局限性。目前相互作用和共存网络之间的关系仍然并不清楚,从网络分析方法推断生态相互作用存在一些技术和理论挑战仍有待解决。如采样的空间尺度和环境梯度对计算物种共存网络结果具有影响,为了从共存网络数据中准确推断生态相互作用,需要仔细考虑采样的分辨率和环境梯度等。另外,实验是进一步探索微生物相互作用的途径,可增进对生态相互作用的理解,在未来的共存网络研究中,如果能结合微生物群落相互作用得到实验验证,对网络分析方法的准确性和可靠性评估将非常重要。

微生物间的共存网络是群落构建机制研究的重要组成部分,有研究利用网络分析来揭示污水处理系统中确定性过程的重要性。如Xu等利用零模型和共存网络揭示了MBR不同通量条件下生物滤池中细菌的群落构建机制,发现低通量生物滤池网络比高通量生物滤池网络连接数更多、平均度和平均聚集系数更高。通过降低通量,细菌间的相互作用增强,环境过滤对低通量生物滤池群落作用更强。同时,他们发现一些低丰度类群属于关键类群,与污染物去除有显著相关性,这表明低丰度/稀有类群在降解污染物方面起着重要的生态作用。Zhang等分析了进水的生物降解性(B/C)对活性污泥微生物群落多样性、构建和共存网络的影响,发现具有最佳生物降解性条件(B/C≈0.5)的微生物群落受益于充足的养分和理想的环境条件,表现出生物多样性高,随机过程影响低,网络模块多;而生物降解性较低(B/C

0.5)的微生物网络更复杂,但模块数量更少。网络拓扑参数表明,具有最佳B/C的微生物群落功能更加多样化,受随机过程影响更小,从而可以更有效地去除污染物和维持系统性能。

和微生物多样性一样,污水处理系统处理工艺、环境条件和运行参数等都会对微生物共存网络有影响。如Xia等比较了奥贝尔型氧化沟(orbal oxidation ditch)和A2/O-MBR(MBR coupled with anaerobic-anoxic-oxicprocess)2种处理工艺下曝气池微生物功能基因和共存网络的差异,发现A2/O-MBR具有更复杂的微生物共存网络,且影响2种工艺微生物功能基因的环境条件不同。Ya等研究了污水处理系统中盐度扰动对厌氧氨氧化菌共存网络和脱氮性能的影响,发现低盐度条件下厌氧氨氧化菌群落具有更高的网络连通性和复杂性,而随着反应器运行时间的发展,所有的网络拓扑特征都趋于接近没有盐度扰动的原始值,说明微生物间群落可以逐渐适应高盐度状态。

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展 望

污水处理系统中的微生物群落研究,通常受到微生物学家和污水处理工程师的关注。两类研究人员对生物群落的结构和功能有着强烈的兴趣,但由于背景的不同,他们的主要研究目的也不同。从事污水处理研究的微生物学家主要把污水处理厂作为微生物生态学研究的理想模型系统,关注数据的收集和分析,以检验特定的科学假设;而工程师们主要关注污水处理厂工艺性能的优化和稳定性,采用的更多是经验方法而非理论方法。整合微生物学家和环境工程等不同学科领域的知识、观念和技术,将污水处理的基础研究与实践相结合,有助于污水处理的研究,这需要微生物学家和环境工程师的积极参与与合作。污水处理工程师应利用生态学理论来指导未来的系统设计,微生物生态学家应将工程生物系统视为生态学研究的新平台,这对应对全球环境变化具有重要意义。同时,这是一个巨大的挑战,只有受过分子微生物学和工程学训练的科学家才能弥合这些领域之间的鸿沟。针对目前污水处理系统微生物群落时空分布和构建模式研究现状,未来还需要在污水处理系统核心微生物、微生物组-环境-系统效能关联,以及将多组学技术应用于微生物时空分布和构建机制研究几个方面开展工作。

1.  污水处理系统核心微生物

了解一个系统的微生物生态学需要将观察到的种群动态与其代谢功能相联系。然而,功能表征是一项艰巨的工作,微生物功能研究的选择应优先考虑核心类群,这些类群通常是丰度或出现频率较高的物种,具有广泛的底物利用范围以代谢复杂和波动的化学物质,并具有更强的抗干扰能力,以抵抗各种抑制微生物生长的因素,对系统性能(如污染物去除、碳转化)的贡献较大。核心类群在污水处理系统中可作为“most wanted taxa”(最想要的类群),培养和表征核心类群并研究其遗传、生化、生理和生态特性对于提高污水处理厂的性能至关重要。已有许多研究关注污水厂的核心微生物的分布和功能。如对丹麦13个污水厂的调查发现,63个高丰度的核心属水平的OTUs占据序列数的68%,很多核心OTUs在亚洲和美国的活性污泥系统中也有检出,表明这些核心类群分布广泛。

值得注意的是,除了高丰度和高出现频率的类群之外,稀有类群也可能在系统中发挥重要作用,成为核心类群。稀有种是群落中的低丰度类群,传统的技术方法很难观测到。高通量测序的发展与成熟,逐步揭示出了稀有生物圈。稀有生物圈具有巨大的多样性,几乎是遗传多样性和功能多样性的无限储存库,尽管如此,绝大多数稀有微生物的生态作用仍不清楚。目前仅有少数研究关注污水处理系统稀有类群的功能和生物地理分布规律。研究发现稀有类群可起到降解污水处理厂中内分泌干扰物的作用;内分泌干扰物可参与水生生物体内雌激素的代谢,表明稀有类群在维持食物网的稳定性中发挥重要作用。有研究者发现:石油化工和厌氧氨氧化-反硝化系统中活性污泥优势和稀有微生物具有不同的群落构建策略和共存网络模式。稀有种在环境条件合适的情况下会转化为优势种。这种丰度的变化将导致污水处理系统微生物结构发生变化,影响污水处理性能,这些类群属于条件稀有种,虽然丰度小,却对生态系统具有较高的贡献度。深入了解核心微生物和稀有生物圈将改变我们对整体微生物群落介导的生态系统功能的认识,更重要的是其将提高对整个污水处理系统性能及稳定性的理解。

2.  微生物群落时空分布、构建机制与污水处理性能的关联

污水处理系统时空分布和构建机制研究是微生物学、生态学和环境工程的交叉学科。如何将污水处理系统微生物群落时空分布规律包括种-丰度分布、距离-衰减关系、分类群-面积关系、分类群-时间关系及生态学理论(群落构建理论)与系统功能联系起来,解析微生物组-环境-系统效能关联,最终服务于污水厂的稳定高效运行,是污水处理系统微生物组研究的核心目标及挑战。微生物群落受环境和空间因素影响,因此可基于微生物群落的分布规律和相关的环境、空间因素来预测它们在空间和时间上的变化。如Ju等将网络相关性和拓扑性分析应用于探索微生物、环境、污水厂性能之间的相互作用,通过微生物、水质指标、运行环境参数在5年时间尺度上的共存网络分析,提出适当延长SRT和维持适宜污泥混合液浓度(mixed liquid suspended solids,MLSS)有利于提高硝化与反硝化菌和起泡菌间的底物竞争能力,进而控制或减少污泥起泡现象。Yu等认为微生物群落构建理论和功能特性可用来诊断污水处理系统性能。他们发现当活性污泥系统相对稳定时,确定性过程尤其是同质选择驱动群落演替,相反,当发生干扰(如污泥膨胀和起泡)时,随机过程增加,一些功能类群很可能被抑制,并导致系统向群落多样性减少、群落生态位宽度下降以及功能冗余的方向转变。因此,随机过程的出现可能表明性能恶化或系统故障,需要采取纠正措施,而确定性过程主导时表明系统具有相对稳定和有效的性能。

大空间和时间尺度对于微生物群落多样性和时空分布研究至关重要。为了准确预测微生物群落的分布,必须尽可能多地收集污水处理厂样本,更好地涵盖污水环境条件和工艺操作条件等信息。环境微生物组中绝大多数微生物仍然难以培养,但研究者们仍致力于获得纯培养菌株的工作。获取活性污泥微生物纯培养物,对于改进基因注释、验证新基因序列功能、理解碳氮磷代谢机制及污染物降解具有重要意义。微生物群落个体数目巨大,因此,未来需开发和借助合理、准确的数学模型与生物信息学工具来认识和推测数量、信息巨大的微生物群落的特征。同时,虽然微生物具有较高的多样性,但DNA与微生物的代谢活性没有直接关系,基于DNA丰度测序得到的信息不能直接反映微生物群落功能,其他生物分子(如RNA和蛋白质)可能比DNA与微生物活性的联系更紧密。因此,提供微生物类群与功能关联的实验观测依据,是证明微生物发挥分解污染物作用的有效方法。随着测序和质谱等技术的飞速发展,宏组学方法、高通量化学组成分析成为研究复杂微生物群体的有力技术之一。未来应多开展污水处理系统微生物分离和培养工作,以达到通过实验方法和多组学测序等手段将特定功能与特定微生物类群相关联的目的。

3. 多组学技术在微生物群落时空分布和构建机制研究中的应用

高通量测序技术的发展促进了扩增子测序技术、各类组学技术在活性污泥微生物群落研究领域的应用。特异性标记基因扩增子测序技术在污水处理系统中的应用极大扩展了研究者对活性污泥微生物群落组成、相互作用和时空分布的认识。扩增子测序难以获得微生物发挥的具体功能,宏组学方法弥补了此缺陷。宏基因组学可在群落、种群和个体基因组水平全面解析微生物组驱动的碳、氮、磷元素循环过程,以及有机污染物的生物降解和转化机理,已被用于研究微生物分布与生态功能之间的联系。宏转录组学以系统中总mRNA为研究对象,揭示生物处理系统中微生物群落的基因表达与调控,可同时解析微生物群落相关基因及其代谢活动。宏蛋白质组的研究可以进行微生物群落的一致性、活性和功能分析,能够提供宏基因组无法获取的信息,在强化生物除磷的活性污泥、活性污泥胞外多聚物研究中起到重要作用。宏组学研究在解析污水处理系统微生物群落功能中发挥重要作用,利用该方法,未来可以更准确地建立微生物时空分布、构建机制与生态功能间的联系,进而精准定向调控微生物组,最大限度地发掘其在污水处理与资源回收领域的工程学与生态学价值。

总之,从揭示微生物群落时空分布格局到调控生态系统功能菌群以服务于污水处理,目前仍然是一个巨大挑战。但随着技术手段和分析方法的不断发展,未来有可能将复杂的微生物群落与其功能耦合,找到更丰富的核心微生物类群和环境及空间驱动因子。