张梦竹*，王睿，李元志
北京梅凯尼克环保科技有限公司，北京 100085；
摘要：在实际污水厂生物处理过程中，功能酶活性对于污染物的去除起着至关重要的作用。选取以Orbal氧化沟为核心工艺的实际污水处理厂为研究对象，分别分析了不同运行模式下，活性污泥中微生物种群结构、关键酶活性及其与污染物去除效率之间的关系。结果表明，适当减少外侧沟道内转刷的开启数量，其沟道内溶解氧分布将发生明显变化，沿水流方向，厌氧或缺氧段明显加长。同时，长期运行结果表明，当进水水质稳定时，运行参数变化并未对整个生物处理工段内微生物种群结构有明显影响。相比而言，羟胺氧化还原酶（HAO）和硝酸还原酶（NR）这两种关键酶的活性对于运行参数改变的响应更为灵敏。并且，分析也表明，HAO和NR活性与氨氮及总氮去除呈正相关，相关系数分别为0.99和0.88。
关键词：污水处理厂；Orbal氧化沟；转刷；羟胺氧化还原酶；硝酸还原酶
第一作者：张梦竹（1987-），女，中级工程师，研究方向：污水及污泥处理及资源化。E-mail：zhangmengzhu@bjmbt.net
*通讯作者，E-mail：zhangmengzhu@bjmbt.net
Key words: Wastewater treatment plant; Orbal oxidation ditch; rotation brush; Hydroxylamine oxidoreductase; Nitrate reductase
生物脱氮在目前城市污水氮素去除过程中起着重要作用[1-3]。已有研究表明，生物脱氮效率取决于硝化反硝化功能微生物的代谢活性[4]。众多研究已经明确了不同反应体系下硝化反硝化功能微生物的种群结构特征，并据此探讨了脱氮效率与这些功能微生物之间的关系[5-7]。然而，在绝大多数实际污水处理厂生物处理单元中，各个处理段（好氧、缺氧、厌氧）极少是独立分隔的，其功能段主要是依据溶解氧含量的差异进行区分。在这种情况下，不同功能段的微生物种群结构并无明显差异。这也使得在实际污水处理厂研究过程中，分析功能微生物差异进而说明其去除效率变得较为困难。
在氮素转化途径中，氨单加氧酶（AMO）和羟胺氧化还原酶（HAO）是硝化反应的限速酶[8]，硝酸盐原酶（NR）和亚硝酸盐还原酶（NIR）是反硝化反应的限速酶[9-11]。理论上，分析关键酶活性从而解析污染物降解过程和效率是最直接且根本的。一直以来关于生物脱氮过程中关键酶的研究还主要集中在酶的纯化和反应机理上[12-14]。近年来，在废水处理过程中关于酶活性的研究已经逐渐展开。研究者们初步分析了与TN去除相关的功能酶种类[15]，并阐述了酶活性水平与运行参数变化之间的关系[16]，探讨了污水处理系统脱氮过程中NR和NIR的特性[17]。然而，这些研究主要集中在实验室小试规模。事实上，实际污水处理厂运行过程比实验室小试装置更加复杂。因此，对于实际污水处理厂关键酶活性与污染物去除效率之间关系的研究是非常必要的。
氧化沟是城市污水处理的三大典型工艺之一[18]，在中国，从20世纪80年代以来，氧化沟工艺一直被广泛采用[19]。本文以Orbal氧化沟为研究对象，分别分析了两种运行模式下的微生物种群结构、功能微生物含量、关键酶活性及污染物去除效率，并对其相互关系进行了探讨。本文的目的是揭示影响实际污水处理厂污染物去除效率的内在因素，以期为今后实际污水处理厂提标改造提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 污水处理厂运行模式概述
本研究是在河南省某市的一实际污水处理厂进行的，该污水厂主体采用Orbal氧化沟工艺，污水处理量为4×104·d-1。其进水水质如表1所示。
研究分别在两种模式下进行，每种模式的运行周期为一年，具体运行参数如表2所示。两种模式的主要区别在于沟道内转刷开启数量不同，模式I，外、中、内沟道转刷开启数量分别为6、4、4；模式II，沟道转刷开启数量分别为4、4、4。每周监测不同模式下进出水水质，同时监测沟道内溶解氧变化，测试位置如图1所示（包括转刷后1 m和下一个转刷前1 m）。同时，在每年6月和12月分别采集沟道内活性污泥样品，用于其微生物种群、功能微生物含量及关键酶活性分析。
表1 两种模式下Orbal氧化沟的进水水质
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|
COD |
NH4+-N |
TN |
TP |
SS |
pH |
|
模式 I |
492-734 |
35.25-48.52 |
42.56-61.25 |
2.25-4.15 |
100-325 |
6.8-7.2 |
|
模式 II |
490-684 |
36.75-47.56 |
45.75-60.25 |
2.65-4.75 |
120-280 |
6.7-7.2 |
表2 两种模式下Orbal氧化沟的运行参数
|
|
模式 I |
模式 II |
|
水力停留时间(h) |
10 |
10 |
|
污泥负荷(kg BOD5·(kg MLSS · d)-1) |
0.13 |
0.13 |
|
污泥龄(d) |
12 |
12 |
|
MLSS(mg·L-1) |
3015 |
2965 |
|
处理能力(×104·d-1) |
4 |
4 |
|
COD 负荷(kg·(m3 · d)-1) |
0.35 |
0.34 |
|
NH4+ -N 负荷(kg·(m3 · d)-1) |
0.038 |
0.038 |
|
转刷开启数量(外/中/内沟道) |
6/4/4 |
4/4/4 |
图1 Orbal氧化沟转刷设置模式及样品采集及测试位点示意图（模式Ⅰ：外沟道RB1、RB2、RB3及对应位置全开，中、内沟道RB1、RB2及对应位置全开；模式Ⅱ：外、中、内沟道均为RB1、RB3及对应位置全开。◆代表采集及测试位点。）
1.2 功能微生物特征
将采集的活性污泥样品，4度保存并运送回实验室，定性和定量分析两种模式下的功能微生物特征。
1.2.1 细菌种群结构分析
采用现代分子生物学技术分析两种运行模式下的细菌种群结构。选用核酸自动提取仪（TanBead, 台湾圆点，中国）分别提取其总DNA，并采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的提取纯度。细菌通用引物F357GC/R518[20]用来扩增细菌16S rDNA片段。PCR产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（DGGE）进行分离（凝胶浓度为8%，变形梯度为30%-60%，Bio-Rad, 美国），电泳时间为16 h。随后采用凝胶成像系统（Bio-Rad, 美国）成像并分析其多样性[20]。
切取DGGE中的优势条带，置于50 μl无菌超纯水中，4 °C下过夜。采用PCR产物回收纯化试剂盒（Cycle Pure Kit，OMEGA，美国）纯化后，委托北京博迈德科技发展有限公司采用ABI 3730XL（3730XL，ABI，美国）测序仪进行测序。将测序所得的序列提交至NCBI数据库，获得登录号为HQ857385-HQ857407。并利用BLAST算法在NCBI数据库中进行序列同源性比对，测序所得序列及比对序列采用MEGA 6.1软件构建系统发育树。
1.2.2 氨氧化细菌（AOB）和亚硝酸盐氧化细菌（NOB）含量测定
采用基于SYBR Green I的荧光定量PCR（RT-PCR）技术，分析两种运行模式下活性污泥中总细菌、AOB和NOB含量。RT-PCR（TaKaRa Code, TP800）反应体系为25 μl，其组成为： 2.5 μl 10×PCR缓冲液、12.5 μl SYBR EX Taq预混液、0.25 μl 30 μm AOB引物和10 μm NOB引物、2 μl模板及标准16S rRNA拷贝；其反应条件为：95°C 30s预变性，95°C 5s变性、65°C 30s延伸，往复45个循环。RT-PCR的引物如表3所示[21-23]。AOB和NOB以相应典型菌株的PCR产物为标准，总细菌以大肠杆菌的PCR产物为标准，建立RT-PCR标准曲线。
表3 定量PCR引物序列
|
|
引物名称 |
序列(5`---3`) |
参考文献 |
|
总细菌 |
1055f |
ATGGCTGTCGTCAGCT |
[21] |
|
1392r |
ACGGGCGGTGTGTAC |
||
|
AOB |
CTO189FA/B |
GGAGRAAAGCAGGGGATGG |
[22] |
|
CTO189FC |
GGAGGAAAGTAGGGGATCG |
||
|
RT1r |
CGTCCTCTCAGACCARCTACTG |
||
|
NOB |
NSR1113f |
CCTGCTTTCAGTTGCTACCG |
[23] |
|
NSR1264r |
GTTTGCAGCGCTTTGTACCG |
1.3 关键酶活性测定
采集运行期间沟道内的活性污泥样品50 ml，4 °C保存并运送回实验室，定量分析两种模式下的关键酶HAO和NR活性。首先将采集的活性污泥进行离心富集（4 °C, 15min, 12000 rpm），然后在0.01 M的磷酸钾缓冲液（pH 7.4）中再悬浮。得到的活性污泥悬浊液通过超声波裂解，并再次离心（4 °C, 15min, 12000 rpm）以去除固体颗粒和细胞碎片，从而得到HAO和NR粗提取物。添加不同浓度 (NH4)2SO4进行纯化[24-26]。
两种反应混合物（A和B）分别用于HAO和NR的检测。反应混合物A：5 ml酶提取液，2 ml 0.5 mM细胞色素C，0.5 ml 2 mM HAc-NaAc缓冲液（pH 5.8）和0.5 ml 1.75 mM羟胺。HAO活性以反应混合物中羟胺的减少量表示。反应混合物B：5 ml酶提取液，1 ml甲基紫（MV+），10 ml 10 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4），10 μl 10 mM DDT以及1 mM NaNO3。NR活性以反应混合物中NaNO3的减少量表示。一个单位的酶活性（U）定义为：每克活性污泥中，每小时转化1 mg催化底物所需酶的量。
1.4 其他分析
进出水的化学需氧量（COD）、氨氮（NH4+-N）和总氮（TN）采用国标方法进行测定[27]。溶氧（DO）和pH值采用CellOx325和SenTix 41-3分别监测，温度采用WTW-Multi 340i（德国）分析仪监测。
2 结果与讨论
2.1 不同模式下污水处理厂运行效果
两种运行模式下，该厂进出水中COD、NH4+-N和TN的监测结果如图2所示。在模式I和模式II下，COD的平均去除率分别为94.28±2.19%和91.79±2.77%；NH4+-N的平均去除率分别为72.80±7.07%和69.36±8.45%；TN的平均去除率分别为25.50±6.83%和44.67±10.96%。同时，图中结果也表明，除冬季外，其余季节在模式II运行条件下，COD、NH4+-N和TN的去除率均明显高于模式I。在4月到10月期间，模式I和模式II的COD的平均去除率分别为96.08±0.87%和94.17±0.73%；NH4+-N的平均去除率分别为81.38±3.47%和80.59±1.39%，TN的平均去除率分别为31.77±5.41%和59.81±5.33%。
图2 两种模式下污水处理厂COD、NH4+-N 和TN的去除效率
2.2 两种模式下不同沟道DO浓度变化特征
在两种运行模式下，分别对Orbal氧化沟三个沟道不同位置处DO浓度进行测定，结果如图3所示。结果表明，DO浓度在转刷前和转刷后有明显不同，特别是在外侧沟道。模式I条件下，转刷后1 m处外渠道的DO浓度为2.28±0.3 mg·L-1，在下一个转刷前1m处外渠道的DO浓度为0.80±0.1 mg·L-1。在模式II条件下，转刷后1 m处外渠道的DO浓度为2.03±0.4 mg·L-1，在下一个转刷前1 m处外渠道的DO浓度为0.16±0.1 mg·L-1。
图3 两种模式下不同沟道转刷前后溶解氧浓度变花
2.3 关键酶活性
分别在夏季和冬季，采集两种运行模式下三个沟道内活性污泥样品，进行关键酶HAO和NR的活性分析。结果显示，在同一运行模式下，与中、内沟道相比，HAO活性在外沟道中最低。相反，NR活性在外沟道中最高。并且，HAO和NR的酶活性在夏季都高于冬季。外沟道中，在模式II条件下NR活性明显高于模式I。模式I下，夏季和冬季的NR活性分别为1.58 mg NO3-·(g MLSS·h)-1和0.80 mg NO3-·(g MLSS·h)-1；而模式II下，夏季和冬季的NR活性分别为2.27 mg NO3-·(g MLSS·h)-1和1.07 mg NO3-·(g MLSS·h)-1。内沟道中，模式I和模式II条件下的HAO活性并无明显区别。模式I下，夏季和冬季的HAO活性分别为2.17 mg 羟胺·(g MLSS·h)-1和1.56羟胺mg·(g MLSS·h)-1；而模式II下，夏季和冬季的HAO活性分别为2.05 mg羟胺·(g MLSS·h)-1和1.42 mg羟胺·(g MLSS·h)-1。
3 讨论
理论上，活性污泥中的微生物种群会随着污水处理运行参数的变化而发生变化。因此，微生物种群结构变化常用来解释运行参数调节后污水处理效果发生变化这一现象[28]。本研究在一实际污水处理厂展开，研究结果显示，当外沟道转刷开启数量改变后，污水厂出水中各污染物的去除效果均发生改变，尤其是TN。适当减少外沟道转刷开启的数量，将有助于TN的有效去除。
对两种运行模式下不同沟道内关键限速酶HAO和NR活性进行分析，结果表明，运行参数的变化直接对关键酶的活性产生了影响，尤其是本研究中外侧沟道中NR的活性。在模式II下，冬季和夏季外侧沟道内NR活性分别比模式I下提高了25%和30%。与此同时，该水厂出水中TN的去除效率也由模式I的25.50±6.83%提高到了模式II的44.67±10.96%。综合分析关键限速酶HAO、NR和TN、NH4+-N去除的关系。结果表明，HAO和NR活性与NH4+-N和TN的去除均呈正相关关系，相关系数分别为0.99和0.88（图4）。也就是说，改变污水厂运行参数，生物处理单位中关键酶活性发生了明显变化，从而改变了污染物的去除效率。
进一步分析两种运行模式下外沟道DO浓度分布特征，发现减少转刷开启数量后，Orbal氧化沟外侧沟道内缺氧或厌氧区段有所增加。这主要是由于减少外侧沟道的转刷数量，也就减少了供氧量，从而改变了外侧沟道的局部微环境条件。赵群英等学者的研究也发现，DO含量的变化对污水出水水质具有明显影响[34]。而这种微环境条件的改变，在不影响其微生物种群结构的情况下，直接提升了沟道内关键酶活性，进而提升了污水出水水质。
也就是说，在实际污水处理厂中，改变运行参数后，相对于微生物种群结构和功能微生物含量而言，关键酶活性的响应更为快速灵敏。因此，这一研究结果对于现行污水处理厂提标改造是具有非常重要的实际参考依据的。
然而，本研究所采用关键酶活性分析仅仅是酶粗提取物的分析，并且仅在一座污水处理厂进行。如要将该方法进一步用于解析实际污水处理厂运行参数变化对处理效果影响原因时，接下来需要更为精准且广泛的研究。例如，结合更多实际污水处理厂的研究，综合分析多种运行参数变化后其关键酶的响应过程；同时，设计小型批量研究实验，对提取的关键酶进行纯化，进而分析不同运行参数条件下关键酶的响应关系。
图4 HAO、NR活性与NH4+-N, TN去除率之间的相关关系
4 结论
通过实际污水处理厂运行参数的改变，可有效提高污水中污染物的去除效率。本研究结果发现，在实际污水处理厂中，运行参数改变后，其生物反应体系中局部环境（例如溶解氧）会及时响应。在此过程中，微生物种群结构在一定程度上仍然保持稳定，并未发生明显变化。但是其中关键酶的活性会随着局部环境条件的变化而即时发生响应，从而改善污染物的去除效率。因此，可将关键酶活性变化作为未来污水处理厂提标改造研究过程中重要的参考依据之一。
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