更新时间：2023-11-25 | 不同强化类型的好氧颗粒污泥结构特性 Structural characteristics of different enhanced aerobic granule

实验共设置4组内径为7 cm、有效水深为105 cm的柱状SBR反应器。每组反应器有效容积为4 L。反应器按6 h周期运行，其中，进水、沉淀、排水时间均为5 min，其余时间曝气，控制曝气量使得表观气速为1.5 cm/s，不设置缺/厌氧期。排水口在底部以上52.5 cm处，换水比为50%。反应器处于恒温室内，温度恒定为25 ℃。

接种的絮体活性污泥取自城市污水处理厂，用0.2 mm的筛网过滤后接种至反应器，接种后反应器内污泥浓度MLSS=3 500 mg/L。进水为人工配水，进水水质为(每升)：500 mg乙酸钠、153 mg NH₄Cl、35 mg KH₂PO₄、30 mg CaCl₂、20 mg MgCl₂、10 mg FeSO₄、1 mL微量元素溶液。微量元素溶液(每升)组分: 0.05 g H₃BO₃、0.05 g ZnCl₂、0.03 g CuCl₂、0.05 g MnSO₄·H₂O·(NH₄)₆、0.05 g Mo₇O₂₄·4H₂O、0.05 g AlCl₃、0.05 g CoCl₂·6H₂O、0.05 g NiCl₂。

根据实验的前期预实验结果与相关参考文献[10-15]，确定了PAC、MBF、GAC 3种凝聚剂的最佳投加方式。

1) 市售30%(w/w)的PAC粉剂配置成33.33 g/L的PAC溶液，每个周期进水时同步投加50 mL PAC溶液，45 d后停止投加。

2) MBF提取自前述污水处理厂的浓缩污泥，提取方法：将TSS=10 g/L的浓缩污泥在-20 ℃和37 ℃条件下反复冻融3次(单次冷冻或融解的作用时间均为12 h)。然后，将100 mL混合液进行超声细胞破碎(SCIENTZ-d2 D)，破碎时间2 min，脉冲4 s，功率密度60%。破碎后的混合液在4 ℃，10 000g条件下高速离心20 min，上清液为MBF溶液^[13]。每个周期进水时同步投加50 mL MBF溶液，45 d后停止投加。

3) GAC的制备与投加方法：将市售的椰壳活性炭高速破碎后，用筛网筛选出粒径为0.15~0.25 mm的颗粒活性炭。在接种絮体活性污泥时一次性投加，使得反应器内GAC浓度为3 500 mg/L，后续不再补加。

用0.1 mol/L磷酸缓冲液(PBS)将颗粒清洗3次后加入100 μL 0.1 mol/L NaHCO₃，然后，用异硫氰酸荧光素(FITC)、刀豆蛋白(Con A)、卡尔科弗卢尔荧光增白剂(calcofluor white)和尼罗红(Nile Red)分别对蛋白质、α多糖、β多糖和脂类进行染色^[16]。在上述每次染色后，均用PBS清洗样品两次，以除去多余的染色剂。将染色后的颗粒在-20 ℃下冷冻切割成60 μm切片，最后，用CLSM(Leica TCS SP2)扫描沿粒径方向荧光强度。

用PBS将颗粒清洗3次后，用2.5%戊二醛固定2 h。然后，分别用50%、75%、90%、100%的乙醇初脱水，再分别用50%、75%、90%、100%的叔丁醇深脱水(单种浓度脱水时长均为5 min)。干燥喷金后进行SEM(Hitachi S-3 400N)观察。

颗粒实际抗剪强度没有统一标准，有研究在厌氧颗粒污泥中采用相对抗剪切强度完整度系数ICs表征^[17]。本实验中作部分修改，具体测定方法为：用0.1 mol/L PBS清洗颗粒(100 mL)3次后定容至100 mL。然后将其置于37 ℃、200 rpm的摇床中振荡30 min。振荡停止沉淀10 s后迅速吸取并测定上清液和沉淀部分的SS，分别记为SS₁和SS₂。完整度系数(Integrity coefficients, ICs)ICs= SS₂/ (SS₁+SS₂)。

用PBS清洗3次后的颗粒分别单独加入2 350 U/μL蛋白酶K、205 U/μL α淀粉酶、5.13 U/μL β淀粉酶、3.14 U/μL脂肪酶，并在37 ℃、150 rpm条件下振荡60 min。振荡停止后，沉淀10 s迅速吸取并测定上清液和沉淀部分的SS，分别记为SS₃和SS₄。抗水解强度系数(Anti- hydrolase coefficients, AHCs)AHCs= SS₄/ (SS₃+SS₄)。

TSS、MLSS等常规指标的测定参考《水和废水监测分析方法(第四版)》。颗粒粒径测定和显微观察均使用光学显微镜Motic BA310。颗粒内部溶解氧DO分布用微电极(Unisense)测定，梯度选取为40 μm，测定时预曝气控制液相DO=6.0 mg/L。PBS缓冲液组分(mmol/L)：NaCl=137，KCl=2.7，Na₂HPO₄=10，KH₂PO₄=2。

研究通过不同强化方法均成功培养出了好氧颗粒污泥(如图 1所示)。对照组、PAC组、MBF组、GAC组好氧颗粒污泥的初形成(粒径＞0.2 mm)时间分别为第42天、第30天、第8天、第28天。颗粒成熟(粒径及各项指标基本稳定)时间分别为第52天、第39天、第22天、第38天。成熟后的4种好氧颗粒污泥平均粒径均在1.2~1.8 mm之间，组间无显著差异。实验结果表明：PAC、MBF、GAC对好氧颗粒污泥的形成有促进作用，且PAC的促进作用最为显著。

1  4种不同好氧颗粒污泥的光学显微观察和扫描电镜SEM的表面结构

 

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从图 1可以看出，4种好氧颗粒污泥的形态特征在光学显微镜下没有明显区别，均为类球形结构，且表面没有丝状菌缠绕。已有研究表明，以乙酸钠为底物培养的好氧颗粒污泥通常不会观察到有丝状菌生长^[18-19]。但4种好氧颗粒污泥的SEM结果却显著不同，其中, 对照组和MBF组的颗粒外层为网状结构，表面粗糙多孔，较为蓬松。PAC强化型好氧颗粒污泥表面呈层状花椰菜结构，没有蓬松网状结构，且层状之间排布紧密。GAC强化型好氧颗粒污泥表面整齐排布着球菌、杆菌，没有网状、层状结构，表层光滑致密。

MBF组和对照组表现出相同的表面结构，表明微生物絮凝剂中提取的有效成分(胞内外蛋白和多糖)^[13]，主要作用是增加了好氧颗粒污泥形成过程中必要的胞外聚合物的含量，但没有改变颗粒化的机理(胞外聚合物假说)。而PAC组和GAC组的表面特性和对照组相比已有显著改变，且这两类好氧颗粒污泥之间的表面特性也完全不同。具体的颗粒化机理在后文结合EPS荧光原位染色和结构稳定性一并详细讨论。

EPS荧光原位染色结果如图 2所示，CLSM扫描结果表征了蛋白质、α多糖、β多糖、脂肪在4种好氧颗粒污泥内部沿半径方向的分布。其中，α多糖和脂肪两种EPS组分在4种颗粒内部的分布规律一致，都分布在颗粒外层。

2  4种好氧颗粒污泥EPS主要组分的内部分布

 

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蛋白质在对照组和MBF组的颗粒内部均匀分布；PAC强化型颗粒外层(0~200 μm)的蛋白质染色剂荧光强度为对照组的2.5倍，内部(300~600 μm)荧光强度与对照组一致；GAC强化型颗粒外层(0~150 μm)的蛋白质染色剂强度与对照组一致，中部(200~400 μm)的荧光强度约为对照组的2倍，由于内部(500~600 μm)为颗粒活性炭，荧光强度基本为零。

β多糖在对照组和MBF组的颗粒内部均匀分布；PAC强化型颗粒外层(0~200 μm)的β多糖染色剂荧光强度为对照组的1/3，内部(300~600 μm)荧光强度与对照组一致；GAC强化型颗粒外部(0~400 μm)β多糖染色剂荧光强度与对照组一致，由于内部(500~600 μm)为颗粒活性炭，荧光强度基本为零。

EPS荧光原位染色的结果与SEM结果相印证：MBF不改变颗粒化机理，成熟的好氧颗粒污泥结构与对照组类似；而PAC组中加入了高分子絮凝剂，起到了吸附架桥和电中和作用，改变了好氧颗粒污泥内部结构，形成了“蛋白外壳-β多糖内核”的双层结构。外层蛋白质含有大量疏水基团，能够抵抗气-水剪切力和增加细胞疏水性^[20-21]，而内层的β多糖有助于微生物间粘附，维持颗粒结构稳定^[22]；GAC组的颗粒污泥内部仅蛋白质的分布发生了显著改变，高浓度的蛋白质将颗粒活性炭包裹，推测是微生物为了附着在颗粒活性炭上而分泌了更多的蛋白质，降低微生物聚集体的表面电荷、增加疏水性，最终聚集吸附在GAC上生长^[23]。α多糖和脂肪主要由活细胞分泌^[24]，二者的分布规律表明，4种颗粒污泥主要活性微生物均分布在颗粒外层(0~300 μm)。

溶解氧在4种不同好氧颗粒污泥中的分布如图 3所示, 蛋白质、α多糖、β多糖、脂肪荧光染色强度沿半径方向分布，筛选用于分析检测的颗粒直径均为1.2 mm。从图中可知，4种颗粒径向溶解氧开始消耗(＜5.5 mg/L)的顺序为：对照组(-300 μm)、MBF组(-250 μm)、PAC组(-100 μm)、GAC组(-50 μm)，径向溶解氧消耗殆尽(＜0.1 mg/L)的顺序为：PAC组(150 μm)、GAC组(250 μm)、MBF组(300 μm)、对照组(350 μm)。

3  4种好氧颗粒污泥在测定梯度为40 μm的溶解氧分布

 

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DO外部变化：对照组和MBF溶解氧的开始消耗大幅度提前于0 μm，表明这两组好氧颗粒污泥表面的结构松散，与液相有一段过渡区，过渡区内可进行物质传输、交换，但松散的结构不利于抵抗外界冲击负荷，且可能发生微生物游离^[25]。PAC组和GAC组的过渡区仅50~100 μm，表明这两类颗粒结构致密，微生物紧密附着生长，能够良好抵抗外界冲击。过渡区形态也能从前述的SEM结果看出，对照组和MBF组的表面存在网状结构，没有清晰的固液界面，而PAC组和GAC组界面轮廓清晰分明。

DO内部变化：从径向溶解氧消耗殆尽的顺序可知，4种好氧颗粒污泥内部结构从紧密到疏松的顺序为PAC组＞GAC组＞MBF组＞对照组。值得特别注意的是，PAC组外层结构比GAC组疏松，但内部结构PAC组更加致密。结合EPS荧光染色结果分析，这与蛋白质的分布有关。PAC强化型好氧颗粒污泥的蛋白质在外部0~200 μm段有高密度分布，GAC强化型颗粒的蛋白质在中部200~400 μm段高密度分布。故推测高密度的蛋白质会使得好氧颗粒污泥结构更加致密，阻挡了DO进一步向内传输，而对照组和MBF组的颗粒污泥蛋白质在整个切片断面上都是中密度分布，因此，DO能更加深入地向内传输。

主要从抗剪强度和抗水解强度两方面研究了4种好氧颗粒污泥的结构强度。由于绝对强度难以测定，且没有统一标准方法，故用相对值表征^[17]，结果分别为完整度系数ICs(表 1)和抗水解酶系数AHCs(图 4)。

1  4种不同好氧颗粒污泥的完整度系数ICs (相对抗剪强度)

数据项	对照组	PAC	MBF	GAC
ICs	92.40	98.62	96.48	98.55
误差	00.45	00.65	01.33	00.94

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4  相对抗水解强度AHCs

 

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表 1表明，4种好氧颗粒污泥承受水力剪切力的能力从强到弱依次为PAC组≈GAC组＞MBF组＞对照组。ICs的结果表明，无论是投加絮凝剂还是载体物质，都能显著提升好氧颗粒污泥的抗剪强度。其中，由于PAC和GAC能显著改变好氧颗粒污泥的外表面结构，使得表层微生物附着、排布更加致密，从而相比于MBF更能提升颗粒抵抗水力冲刷的能力。实际运行中，可能由于操作调控不及时，导致曝气量与水量不匹配，进一步使得反应器内曝气不均匀，气水紊流程度加剧，最终造成颗粒污泥解体、出水恶化^[5]。但是，使用强化型好氧颗粒污泥可有效改善此类问题的不利后果。

从图 4可以看出，当蛋白质被水解后，PAC组和GAC组的AHCs值在85%~90%范围内，表明这两组的颗粒均发生轻微解体，而对照组和MBF组的颗粒未发生解体现象。当β多糖被水解后，4种颗粒污泥都发生不同程度的解体，抗β多糖水解酶能力的顺序依次为：PAC组＞GAC组＞MBF组＞对照组。

已有研究证实，EPS中的β多糖具有胶状黏性特征，是维系好氧颗粒污泥结构完整性的主要物质，而非传统生物学观点认为的蛋白质^[22]。许多研究用β淀粉酶对普通好氧颗粒污泥作用后均观察和检测到了颗粒的破碎和解体，在本实验中也有同样结论。但是，从AHCs结果中可以看出，4种好氧颗粒污泥水解程度显著不同，对其原因推测如下。

由于PAC的加入，颗粒化机理发生改变，起决定性作用的是PAC的吸附架桥和电中和的双重功效，故水解β多糖后颗粒仅轻微破碎。同时，由于PAC强化型颗粒形成了致密的蛋白外壳，也在一定程度上对颗粒结构有保护作用，因此，在水解蛋白质后PAC组的AHCs有轻微下降。同时，该组颗粒污泥形成了β多糖内核，其可能原因是由于PAC的加入，使得生物残体、无机质等一系列物质，在胶状β多糖和絮凝剂PAC双重作用下形成了类似于惰性晶核载体物质，其具体作用机理需要进一步深入研究；投加MBF只是增加了微生物可利用的EPS中各种物质的种类和数量，没有从根本上改变颗粒化机理，因此，水解β多糖颗粒破碎程度比较显著，AHCs值下降明显；而投加GAC，促使内层微生物分泌蛋白质附着在颗粒活性炭表面生长，从而改变了内部微生物聚集机理，内层结构稳定性不再由β多糖决定。而EPS荧光染色结果表明其颗粒外部组分与对照组无异，导致β多糖水解后，外层颗粒破碎解体，内层依旧维持一定的形态，所以，AHCs值下降程度显著小于对照组。

对结果的分析讨论表明，对照组和MBF组的颗粒污泥形成机理符合“EPS假说”，PAC组和GAC组的颗粒污泥的形成机理符合“晶核假说”^[26]。但具体的微观形成过程，以及微生物与微生物之间、微生物与载体之间的信号传递、相互作用等都还需要更进一步的深入研究。