虽然不依赖培养的方法在表征微生物进化和生态方面取得了重大进展，但分离物对于强大的功能研究和可靠的应用仍然是不可或缺的。尽管如此，这个被称为“大板块数异常”的谜题持续了一个多世纪。在典型的环境样品中，通常通过显微镜或流式细胞术测定的细胞总数与琼脂板上的集落形成单位（CFUs）之间的差异相差几个数量级。用最可能的计数方法在液体培养基中获得了相似或更高比例的可培养细胞。结果，相当大比例的环境原核生物被认为是未培养或无法在实验室中培养的，包括那些被称为“微生物暗物质”或候选分支的生物，这些生物谱系缺乏任何具有代表性的高分类等级分离物。一个普遍的误解是可培养细胞的比例（PCC）和可培养分类群的比例（PCT）之间的混淆。几乎所有以前的研究都是测量PCC，而不是关注可培养分类群（如物种）相对于接种物中存在的总分类群的比例。为了准确评估可栽培多样性，必须利用马丁尼提出的PCT。还基于16S rRNA基因数据库进行了PCT估计，引起了人们对分类群可培养性可能被低估的担忧。然而，随后的讨论认为，这一结论是基于一个固有偏见的概念。它进一步强调，除非在一定条件下成功培养，否则不可能确定微生物的可培养性。

造成环境微生物可培养性低的主要因素已被广泛记录，包括不利条件（例如，非最佳理化条件，活性氧的存在和某些生长因子的缺乏），休眠，许多物种的稀有性和其他限制。为了提高可耕性，采用了多种策略，如原位栽培、栽培组学和创新装置的使用。其中，培养组学方法尤为突出。它涉及在多种培养条件下使用易于使用的琼脂板来扩大可培养的多样性，以及快速的分类方法（例如，质谱和16S rRNA测序）。这种方法导致从人类肠道微生物组中发现了许多新的分类群。然而，在时间和成本方面，详尽地挑选和识别所有菌落通常是不切实际的，特别是在处理多个样品和各种培养条件下的数百甚至数千个琼脂板时。此外，据报道，在实验室培养过程中可以形成肉眼看不见的微菌落。虽然这些微菌落是可培养的，但它们在分离过程中很可能被忽视。报道了一种具有成本效益的平板测序方法，用于对生长在琼脂平板上的所有可培养类群进行分类分析并指导分离。然而，由于样本范围和培养条件的限制，研究未发现具有较高分类等级的新分类群。

研究中同时测量PCT和PCC的图解（图源自Nature Communications ）

培养未培养微生物类群的另一种策略是根据它们的基因组预测它们的代谢特征。这种方法利用了通过培养独立的高通量测序方法获得的丰富的基因组数据。然而，传统的代谢重新建立可能无法指导分离实验证实在标准条件下不可培养的分类群（即在胁迫诱导条件下故意抑制其他可培养分类群，如在生长培养基中添加抗生素）。据所知，这一策略的成功案例很少。研究认为，在特定的培养条件下，可培养、不可培养的结果可以被视为一种表型，可以通过基因组挖掘策略将其与基因型联系起来。随后，这些基因型可能为这些分类群的基本培养条件提供见解。

研究着手通过实验确定两种环境样品的PCT和PCC：土壤和活性污泥（AS），其中含有高度可培养和不可培养的细菌多样性。研究采用了一种简化的培养方法，强调氧气的可用性（即有氧、厌氧和微嗜氧条件，分别缩写为AE、AN和MI）和两种培养基（普通实验室培养基和相应环境样品的提取培养基，后者被证明在环境细菌培养中具有优势）来描述可培养、不可培养的细菌分类群。虽然不是所有的条件都测试了所有的样本。收集生长在琼脂板上的细胞，并进行高通量测序以进行分类和基因组分析。PCT计算为琼脂平板上检测到的扩增子序列变异（ASVs，作为分类标记）与接种物中扩增子序列变异的比值。研究的两个主要目的是：(1)比较PCC和PCT，从而推断之前对环境细菌可培养性评估的潜在偏差；(2)参照细菌可培养表型，提高可培养性。对于后者，研究人员采取了两种可能的策略：一种是在特定培养条件下对可培养细菌进行综合分析，以便从特定样品中有针对性地分离出高分类水平的新分类群；另一种是利用特定细菌谱系中可培养和不可培养分类群之间的比较基因组学来探索改善培养条件和加强不可培养分类群培养的线索。

参考消息：

https://www.nature.com/articles/s41467-024-53446-4